M生物智慧库丨第1期
2023-07-06

第1期:培养基中微量金属在CHO细胞代谢中的作用以及对重组蛋白生产的影响


M生物智慧库丨第1期(图1)


摘要:“过程生物化学”—— 微量金属在细胞代谢中的作用以及它们对重组蛋白生产的影响

Anuja Prabhu a,, Mugdha Gadgilb a,b,*

a Chemical Engineering and Process Development Division, CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, 411008, India

b Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), Ghaziabad, 201002, India



微量金属离子在中心碳代谢中的作用

许多参与糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化的酶需要金属辅因子,培养基中常见的微量金属:Mg、Ca、Mn、Fe、Co、Zn、Cu等。


锰、锌和铜在中心碳代谢中的作用

Mn2+在超氧化物歧化酶(SOD)功能中至关重要,是异源反应和同源反应的丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的辅因子;同时也作为精氨酸酶、精胺酸酶和谷氨酰胺合成酶的辅因子影响氨基酸代谢。在小鼠和Huntington‘s病细胞模型中,精氨酸酶活性降低,是由于Mn2+生物利用度降低导致,而添加Mn2+可以恢复。精氨酸酶将精氨酸转化为尿素和鸟氨酸,后者通过鸟氨酸脱羧酶进一步转化为胍胺。与此一致的是,随着Mn2+的增加观察到了胍胺的增加。SLC39A8 Mn2+内流转运蛋白表达的变化会影响细胞内Mn含量和精氨酸酶活性,突出了金属转运蛋白在其摄取和稳态中的重要性。


锌不是直接涉及糖酵解或三羧酸循环酶的辅因子,但是通过敲除Zn2+转运体介导的锌缺乏会影响葡萄糖代谢。Zn2+控制胰岛素表达、受体活性和信号事件,从而可以影响葡萄糖稳态。Zn2+本身也已知可以在细胞中激活胰岛素介导的信号传导,并被用作培养基中胰岛素的替代物。


铜是细胞色素氧化酶和Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)的重要组成部分,因此参与细胞内的氧化磷酸化和减缓活性氧(ROS)。此外,Cu2+缺乏会增加乳酸的积累,可以通过Cu2+补充来缓解。在Cu2+缺乏的条件下,CHO细胞中丙酮酸、山梨醇、乳酸和其他糖酵解中间产物的积累增加,这被认为是细胞TCA循环效率降低和细胞氧化能力受损的结果。通过13C代谢通量分析比较Cu2+缺乏和Cu2+补充的CHO细胞培养物也表明,当乳酸产生增加时,通过TCA循环和磷酸戊糖途径(PPP)的通量会减少。



微量金属对CHO细胞代谢和重组蛋白质质量的影响

在CHO细胞培养中添加微量金属离子混合物已被证明可以通过提高细胞生长、延长培养寿命和提高重组蛋白产量来提高培养性能。在摇瓶和生产规模反应器中,不同来源的低氧或氧化应激可能会影响培养效。


1. 锰元素改变了CHO细胞生产的重组蛋白的糖基化

Mn2+是寡糖酰转移酶的辅因子,其在培养基中的补充可以提高N-糖基和O-糖基的占位率。Mn2+也是糖基化酶β1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GlcNAc-TI)和半乳糖转移酶的必需辅因子,影响蛋白质的糖基化。Mn2+在0.4-4μM的浓度下的添加可以提高半乳糖基化和唾液酸基化。同时,Mn2+和半乳糖的补充可以缓解高细胞密度和氨积累引起的糖型异常,在滞后期和固定期控制添加Mn2+和半乳糖的补料策略可以在增加培养时间的同时保持恒定的糖型分布高浓度的Mn2+能够增加高甘露糖(M5)的糖基,补充40 μM的Mn2+会增加M5,A2糖基的含量,从而减少半乳糖基和岩藻糖基。在补充100 mM半乳糖和NH4Cl的培养基中进一步增加了M5和A2的含量,并且显著降低了G0F(FA2)。在同时存在半乳糖和葡萄糖的培养基中,通过补充0.35 μM-20 μM的Mn2+,高甘露糖也有类似的增加。在缺乏或限制葡萄糖的情况下,通过补充4 μM和16 μM的Mn2+,高甘露糖的含量也得到了显著增加。


2. 铜元素改变了CHO细胞生产的重组蛋白的糖基化

在添加5-1000μM的Cu2+可以降低CHO细胞培养中的乳酸积累或消耗殆尽,同时提高活细胞密度、延长培养时间和提高重组蛋白产量。在大型生物反应器中, 添加0.2μM和0.4μM 的Cu2+不影响乳酸水平。在CHO中,类似浓度的Cu2+升高可以增加EPO产量,而IgG产量会降低。在生产规模的生物反应器中,Cu2+的添加可以降低细胞死亡和ROS的产生。随着Cu2+的添加,谷胱甘肽过氧化物酶和纤维连接蛋白减少,而SOD1增加。因此,促进细胞生长和抑制凋亡的因子被上调。

铜还会影响蛋白质质量。随着Cu2+浓度的增加,重组蛋白质的半乳糖基化降低。高浓度的Cu2+ (0.1-1 mM) 也可以通过抑制唾液酸酶活性并稳定唾液酸来改善唾液酸化的糖基化。在CHO细胞培养中加入较低浓度的Cu2+ (5μM) 可以增加单体的含量,而在高浓度(50-100 μM)下会增加mAbs的聚集体


 3. 锌对CHO细胞培养和重组蛋白质质量的影响

Zn2+通过AKT和ERK1/2介导的途径激活胰岛素依赖通路,参与抗氧化机制,防止氧化应激。当锌离子浓度超过100μM后,重组IgG的半乳糖基化会显著降低,呈剂量依赖性。然而,这种影响可以通过添加锰离子来抵消。最近的一项研究报告称,重组β-葡萄糖醛酸酶的岩藻糖基化会在添加了50-100 μM锌离子而降低微量金属离子的可用性可以改变细胞代谢和生长,因此,其最佳补充是必不可少的,特别是化学成分限定的培养基配方中。微量金属对培养性能和产品质量的影响进行分类,有助于根本原因分析,并确保生产过程的一致性和可重复性。



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